MK-2206 Akt抑制实验|MK-2206 2HCl

MK-2206基本信息

MK-2206（MK-2206 2HCl；MK-2206 dihydrochloride）是Akt1/2/3的高度特异性抑制剂（IC50分别为:8/12/65 nM），其对250种其他蛋白激酶的活性没有影响，同时具有抗癌活性。很多细胞系对其敏感，如乳腺癌细胞系、突变体PIK3CA 和 PTEN 丢失细胞系等。

货号：ajci16850

别名：MK-2206 2HCl；MK-2206 dihydrochloride；MK 2206

CAS：1032350-13-2
分子式：C25H21N5O.2HCl
分子量：480.39
纯度：＞99%

溶解度：≥ 12.01mg/mL in DMSO

存储：Store at -20°C

MK-2206体外活性

MK-2206自身可导致以下8个IC50在3.4和28.6μmol/L之间的细胞系的生长抑制，单独使用MK-2206可更有效地抑制Ras野生型（WT）细胞系（A431、HCC827和NCI-H292；IC50分别为5.5, 4.3, and 5.2 μmol/L），Ras突变细胞系（NCI-H358、NCI-H23、NCI-H1299和Calu6；IC50分别为13.5、14.1、27.0和28.6μmol/L），NCI-H460除外,它具有PIK3CA E545K突变（IC50，3.4μmol/L）[2]。MK-2206以剂量依赖性方式抑制四种NPC细胞系的生长并减小菌落大小。在72和96小时，CNE-1、CNE-2和HONE-1细胞系中MK-2206的半最大抑制浓度（IC50）值为3-5μM，而在SUNE-1中，IC50小于1μM，MK-2206诱导细胞周期停滞在G1期[3]。

MK-2206体内活性

在Erlotinib（埃罗替尼）（50 mg/kg）给药2小时后口服MK-2206（120 mg/kg），给药14小时后分离肿瘤。单独使用MK-2206中度抑制磷酸化Akt（53.1±6.2%），轻度抑制磷酸化ERK（27.7±5.9%）；单独使用厄洛替尼仅中度抑制磷酸化Erk，而仅轻微抑制肿瘤中的磷酸化Akt；两者协同处理增强了磷酸化Akt（79.9±3.1%）和磷酸化Erk（53.5±5.8%）的抑制作用[2]。与对照组（30%Captisol稀释液）相比，MK-2206剂量（每周一次480 mg/kg和每周三次240 mg/kg）均可抑制裸鼠体内人CNE-2异种移植物的生长。在两个MK-2206组中，肿瘤重量比对照组轻得多，即在接受MK-2206治疗后，观察到短暂的体重减轻[3]。

MK-2206激酶实验

Akt激酶分析：Akt激酶通过GSK-derived biotinylated peptide substrate进行分析。肽磷酸化的程度通过使用对磷酸肽特异的镧系元素螯合物（Lance）偶联的单克隆抗体与链霉抗生物素蛋白连接的别藻蓝蛋白（SA-APC）荧光团组合的均相时间分辨荧光（HTRF）来确定肽上的生物素部分。当喷枪和APC靠近时，从喷枪到APC发生非辐射能量转移，然后在655nm处从APC发射光。工作溶液：100X蛋白酶抑制剂混合物（PIC）：1mg/mL苯甲脒，0.5mg/mL胃抑素，0.5mg/mL亮肽素,0.5mg/mL抑肽酶；10X测定缓冲液：500mM HEPES，pH7.5、1%PEG，16.6 mM EDTA，1 mM EGTA，1%BSA，20 mM 9-甘油磷酸酯；淬灭缓冲液50 mM HEPES pH 7.3、16.6 mM EDTA，0.1%BSA，0.1%Triton X-100、0.17 nM标记的单克隆抗体，0.0067 mg/mL SA-APC；ATP/MgCl2工作溶液：1X测定缓冲液，1mM DTT，1X PIC，5%甘油，活性Akt；肽工作溶液：1X测定缓冲液，1 mM DTT，1X PIC，5%甘油，2 TM GSK生物素化肽。通过向适当的孔中加入16μlATP/MgCl 2工作溶液来组装反应。加入MK-2206或载体（1.0μL），然后加入10μL肽工作溶液。通过添加13μL酶工作溶液并混合开始反应。使反应进行50分钟，然后通过添加60μL HTRF淬灭缓冲液终止反应。将终止的反应在室温下孵育至少30分钟，然后在仪器中读取。[11]

MK-2206细胞实验

将细胞以每孔2至3×10³的密度接种在96孔板中。铺板后24小时，将不同浓度的药物（作为单一药剂或组合）加入孔中。通过在给药后72或96小时使用CellTiter-Glo测定来确定细胞增殖。根据Chou和Talalay的方法，通过使用组合指数（CI）评估药物相互作用的性质，商业软件包从Calcusyn获得。与Docetaxel（多西紫杉醇）组合，我们测试了三种处理顺序：（a）将MK-2206和多西紫杉醇细胞暴露于MK-2206 24小时，然后在冲洗MK-2206后，用多西紫杉醇处理细胞另外72小时；（b） 将多西紫杉醇和MK-2206-细胞暴露于多西紫杉醇24小时，然后在多西紫杉醇洗脱后，将细胞用MK-2206再处理72小时；（c）同时处理细胞暴露于MK-2206和多西紫杉醇72小时。细胞系：A431，HCC827，NCI-H292，NCI-H358，NCI-H23，NCI-H1299，Calu-6和NCI-H460细胞。[2]

MK-2206动物实验

当SK-OV-3的平均肿瘤大小达到0.13 cm3或NCI-H292、HCC70、PC-3和NCI-H460模型的平均肿瘤大小达到0.2 cm3时，将小鼠随机分为对照组和治疗组，各组之间的肿瘤体积范围大致相等（每组n=5只动物）。使用以下载体给化合物投加剂量：MK-2206用30%Captisol（SBE-β-CD (Sulfobutylether-β-Cyclodextrin)）；Erlotinib（埃罗替尼）0.5%甲基纤维素+0.1%吐温80；Lapatinib(拉帕替尼)蒸馏水；Docetaxel（多西紫杉醇）0.73%乙醇生理盐水；和盐水Carboplatin (卡铂)和Gemcitabine(吉西他滨)。对照组仅接受药物治疗。每周两次用卡钳测量肿瘤体积。实验期间监测动物体重和体征。采用以下公式计算肿瘤体积：（长度×宽度）2×0.5，长度为穿过肿瘤的最长直径，宽度为垂直直径。通过将不同观察日的肿瘤体积除以起始肿瘤体积来评估相对肿瘤体积。采用双向重复ANOVA检验、Dunnett检验或非配对t检验评估统计学显著性[2]。

MK-2206质检HNMR

考虑到溶解性，我们采用氘代甲醇作溶剂，400MHz核磁共振波谱仪检测样品氢谱，从化合物结构分析氢谱应出18=23-2（盐酸氢）-3（胺氢），从HNMR谱图可看出各氢及归属与理论完全相符，且无杂质峰，纯度＞99%

MK-2206参考文献

1. Yan L. MK-2206: a potent oral allosteric AKT inhibitor. AACR Annual Meeting 2009: Abstract Number: DDT01-1.

2. Hirai H, et al. MK-2206, an allosteric Akt inhibitor, enhances antitumor efficacy by standard chemotherapeutic agents or molecular targeted drugs in vitro and in vivo. Mol Cancer Ther. 2010 Jul;9(7):1956-67.

3. Zhao YY, et al. Effects of an oral allosteric AKT inhibitor (MK-2206) on human nasopharyngeal cancer in vitro and in vivo. Drug Des Devel Ther. 2014 Oct 10;8:1827-37.

4. Jin J, Zhao Y, Guo W, et al. Thiocoraline mediates drug resistance in MCF-7 cells via PI3K/Akt/BCRP signaling pathway[J]. Cytotechnology. 2019 Feb;71(1):401-409.

5. He J, Zhang A, Song Z, et al. The resistant effect of SIRT1 in oxidative stress-induced senescence of rat nucleus pulposus cell is regulated by Akt-FoxO1 pathway[J]. Bioscience reports. 2019 May 10;39(5). pii: BSR20190112.

6. Lv W, Huan M, Yang W, et al. Snail promotes prostate cancer migration by facilitating SPOP ubiquitination and degradation[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2020, 529(3): 799-804.

7. Lv, Wei, et al. Snail promotes prostate cancer migration by facilitating SPOP ubiquitination and degradation. Biochemical and Biophysical Research Communications . 529.3 (2020): 799-804.

8. Li Z, Zhou Z, Wu X, et al. LMP1 promotes nasopharyngeal carcinoma metastasis through NTRK2-mediated anoikis resistance[J]. American journal of cancer research . 2020, 10(7): 2083.

9. Zhou C, Du J, Zhao L, et al. GLI1 reduces drug sensitivity by regulating cell cycle through PI3K/AKT/GSK3/CDK pathway in acute myeloid leukemia[J]. Cell Death & Disease. 2021, 12(3): 1-14.

10. Zhang L, Zhou Q, Qiu Q, et al. CircPLEKHM3 acts as a tumor suppressor through regulation of the miR-9/BRCA1/DNAJB6/KLF4/AKT1 axis in ovarian cancer[J]. Molecular Cancer. 2019, 18(1): 1-19.

11. Cheng Y, et al, Cancer Res, 2011, 71(7), 2654-2663.