LY294002 实验说明书
基本信息
LY294002 是一种广谱的 PI3K 抑制剂，分别抑制 PI3Kα、 PI3Kδ 和 PI3Kβ,其IC50为 0.5、 0.57、 0.97 μM，还抑制 CK2 、IC50 是98 nm。LY294002 也是一种竞争性的 DNA-PK 抑制剂，可逆地结合到 DNA-PK 的激酶结构域，IC50 是 1.4 μM。LY294002 是一种凋亡激活剂，能阻断自噬体形成。
货号：ajci15212
别名：SF 1101, NSC 697286
化学名：2-morpholin-4-yl-8-phenylchromen-4-one
CAS：154447-36-6
分子式：C19H17NO3
分子量：307.34
纯度：＞99%
溶解度：≥ 40.37mg/mL in DMSO, ≥ 13.55mg/mL in EtOH
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体外活性
LY294002（5μM）可阻断CHO-IR细胞中胰岛素诱导的PKB Ser473磷酸化[1]。当细胞在含有20μM的LY294002的培养基中培养48小时，LoVo和Colo205细胞的增殖显著降低（>80%）。添加LY294002（10–50μM）24小时后，以浓度依赖性方式显著减少DLD-1细胞的数量[2]。当细胞在含有不同浓度LY294002（浓度分别为0、10、25、50和75μM）的培养基中培养24小时和48小时时，细胞增殖以剂量依赖性方式显著降低[3]。
体内活性
A组小鼠静脉注射LY294002，可显著抑制来源于DLD-1和LoVo细胞的s.c.肿瘤的生长，平均体积分别为72%（范围48-82%）和55%（范围40-61%）[2]。与对照组相比，使用LY294002（给药剂量：50 mg/kg，75 mg/kg）治疗显著降低了鼻咽癌的平均肿瘤负荷。10 mg/kg或25 mg/kg LY294002治疗在降低肿瘤负荷方面效果较差[3]。
激酶实验
使用纯化后的重组酶（IA类和IB类）和1μM ATP，在放射分析中确定LY294002对PI3K的抑制作用。激酶反应在室温（24℃）下进行1小时，并通过加入PBS终止。随后使用S形剂量-反应曲线拟合（可变斜率）确定IC50值。通过激酶选择性筛选建立CK2和GSK3β（糖原合酶激酶3β）抑制。LY294002抑制剂（10 μM）针对 10 μM ATP 中的 Upstate 激酶组进行了测试[4]。
细胞实验（仅供参考）
将细胞以 5000 个细胞/孔接种到 96 孔板中。 细胞接种后 24 小时，LY294002溶解在 DMSO 中（0 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L 和 75 μmol/L），去除培养基并更换成LY294002溶液，或 DMSO 仅用于额外的 24 小时和 48 小时。 为了避免 DMSO 对细胞生长的任何非特异性毒性作用，所有实验中 DMSO 的浓度都保持在 0.5%。 将 MTT 染料 (5 mg/mL) 添加到每个孔中。 通过加入 DMSO 终止，并在多孔板读数器上测量 490 nm 处的光密度。 减去不存在细胞时培养基的背景吸光度。 所有样品一式三份测定，并计算每个实验的平均值。[3]。 细胞系：结肠癌细胞系 DLD-1、LoVo、HCT15 和 Colo205
动物实验（仅供参考）
无胸腺裸鼠在6-8周时开始实验， 将小鼠随机分为五组（n = 4 只）。 小鼠被安置在具有受控温度、湿度和 12 小时光/暗循环的相同环境中。 将 CNE-2Z 细胞（1 × 10^6 细胞/小鼠，在 200 μl RPMI-1640 中）皮下接种到小鼠的侧腹中。 肿瘤取瘤率为100%。 1周后，对异种移植小鼠进行不同剂量的LY294002（10 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg和75 mg/kg每周两次（n = 4只小鼠））腹腔注射 4周。治疗的小鼠监测所有行为迹象，每周测量两次体重和肿瘤大小。使用卡尺测量肿瘤大小并计算肿瘤体积（体积=长轴×短轴^2）。[3]
质检
HNMR检测：考虑到溶解性，我们采用氘代DMSO作溶剂，400MHz核磁共振波谱仪检测样品氢谱，从化合物结构分析17个氢均出，从HNMR谱图可看出产品纯度非常高，各氢个数、化学位移及归属与理论完全相符，且无杂质峰，纯度＞99%。
HPLC检测：同时我们还做了高效液相色谱（HPLC）检测，选取214 nm波长，产品在保留时间5.656出峰，纯度为99.93%。
参考文献
[1]. Chaussade C, et al. Evidence for functional redundancy of class IA PI3K isoforms in insulin signalling. Biochem J. 2007 Jun 15;404(3):449-58.
[2]. Semba S, et al. The in vitro and in vivo effects of 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-chromone (LY294002), a specific inhibitor of phosphatidylinositol 3'-kinase, in human colon cancer cells. Clin Cancer Res. 2002 Jun;8(6):1957-63.
[3]. Jiang H, et al. Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor(LY294002) induces apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma in vitro and in vivo. J Exp Clin Cancer Res. 2010 Apr 22;29:34.
[4]. Gharbi SI, et al. Exploring the specificity of the PI3K family inhibitor LY294002. Biochem J. 2007 May 15;404(1):15-21.
[5]. Chen Y, Sun Y, Zhao W, et al. Elevated SRC3 expression predicts pemetrexed resistance in lung adenocarcinoma[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy. 2020, 125: 109958.
[6]. Wen Y, Peng D, Li C, et al. A new polysaccharide isolated from Morchella importuna fruiting bodies and its immunoregulatory mechanism[J]. International Journal of Biological Macromolecules. 2019, 137: 8-19.
